A β-oxidação é um processo catabólico de ácidos graxos que consiste na sua oxidação mitocondrial. Eles sofrem remoção, por oxidação, de sucessivas unidades de dois átomos de carbono na forma de acetil-CoA. Como exemplo pode ser citado o ácido palmítico, um ácido graxos de 16 carbonos, que vai sofrer sete reações oxidativas, perdendo em cada uma delas dois átomos de carbono na forma de acetil-CoA. Ao final desse processo os dois carbonos restantes estarão na forma de acetil-CoA.

A β-oxidação é dividida em quatro reações sequenciais:

1. Oxidação, na qual o acil-CoA é oxidado a enoil-CoA, com redução de FAD a FADH2
2. Hidratação, na qual uma dupla ligação é hidratada e ocorre a formação de 3-hidroxiacil-CoA
3. Oxidação de um grupo hidroxila a carbonila, tendo como resultado uma beta-cetoacil-CoA e NADH
4. Cisão, em que o β-cetoacil-CoA reage com uma molécula de CoA formando um acetil-CoA e um acil-CoA que continua no ciclo até ser convertido a acetil-CoA

Mas quando a cadeia de ácidos graxos for ímpar, o produto final da β-oxidação será o propionil-CoA, esse composto, através da incorporação de CO₂ e gasto energético através de quebras de ligações do ATP, se transforma em succinil-CoA, que é um composto do Ciclo de Krebs.

Após a β-oxidação, os resíduos acetila do acetil-CoA são oxidados até chegarem a CO₂, o que ocorre no ciclo do ácido cítrico. Os acetil-coa vindos da oxidação vão entrar nessa via junto com os acetil-coA provenientes da desidrogenação e descarboxilação do piruvato pelo complexo enzimático da piruvato desidrogenase. Nessa etapa haverá produção de NADH e FADH₂ para suprir de elétrons a cadeia respiratória da mitocôndria, que os levará ao oxigênio. Junto a esse fluxo de está a fosforilação do ADP em ATP. Com isso a energia gerada na oxidação de ácidos graxos vai ser conservada na forma de ATP.